Diagnosis of blackleg from cattle tissue impregnated in common filter paper / Diagnóstico de carbúnculo sintomático a partir de papel filtro comum impregnado com tecido bovino

ABSTRACT: Blackleg, an acute myonecrosis caused by Clostridium chauvoei, is usually underdiagnosed since the rapid transport of adequate samples for laboratory testing is difficult. This study tested a direct polymerase chain reaction (PCR) technique using common filter paper impregnated with cattle tissue samples obtained from animals suspected with blackleg. Twenty-five samples, belonging to eleven animals from Rio Grande do Sul State, Brazil, were analyzed. The direct PCR technique identified eight positive animals corroborating with results from microbiological culture. Skeletal muscle was the most common tissue type used in this study and when the animal was positive the pathogen was always detected in this tissue. Storage time of the impregnated filter paper at room temperature did not prove to be a limiting factor for the quality of the results indicating that this procedure can be carried out in the field and samples be sent in regular mail. Our results suggested that direct PCR of common filter paper impregnated with cattle tissue is a practical and economical alternative for the diagnosis of blackleg.

RESUMO: Carbúnculo sintomático, uma mionecrose aguda causada por Clostridium chauvoei, costuma ser subdiagnosticada, pois o transporte rápido de amostras adequadas para exames laboratoriais é complicado. O objetivo deste estudo foi testar a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) direta, utilizando papel filtro comum impregnado com amostras de tecido bovino obtidas de animais suspeitos de carbúnculo sintomático. Foram analisadas 25 amostras, pertencentes a onze animais do estado do Rio Grande do Sul, Brasil. A técnica de PCR direta identificou oito animais positivos, corroborando com os resultados da cultura microbiológica. O músculo esquelético foi o tecido mais utilizado neste estudo e quando o animal foi positivo, o patógeno sempre foi detectado neste tecido. O tempo de armazenamento do papel filtro impregnado, à temperatura ambiente, não se mostrou um fator limitante para a qualidade dos resultados, indicando que esse procedimento pode ser realizado no local e as amostras enviadas por correio normal. Nossos resultados sugerem que a PCR direta usando papel filtro comum impregnado com tecido bovino é uma alternativa prática e econômica para o diagnóstico de carbúnculo sintomático.

Diversity of pectobacterium strains by biochemical, physiological, and molecular characterization / Diversidade de cepas de Pectobacterium por caracterização bioquímica, fisiológica e molecular

Pectobacterium is a complex taxon of strains with diverse characteristics. It comprises several genera, including Erwinia, Brenneria, Pectobacterium, Dickeya, and Pantoea. Pectobacterium and Dickeya cause diseases in a wide range of plants, including potatoes, where they are causative agents of soft rot in tubers and blackleg in field-grown plants.Characterizing Pectobacterium species allows for the analysis of the diversity of pectinolytic bacteria, which may support control strategies for plant bacterial diseases. The aim of this study was to perform biochemical, physiological, and molecular characterizations of Pectobacteriumspp. from different sites and host plants. The isolated strains were characterized by the glucose fermentation test, Gram staining, catalase activity, oxidase activity, growth at 37 ºC, reducing substances from sucrose, phosphatase activity, indole production, acid production from different sources (sorbitol, melibiose, citrate, and lactose), pathogenicity in potato, and hypersensitivity reactions. Molecular characterization was performed with species-specific primers ECA1f/ECA2r and EXPCCF/EXPCCR, which identify P.atrosepticum and P.carotovorum subsp. carotovorum (Pcc), respectively, and with primers 1491f/L1RA/L1RG and Br1f/L1RA/L1RG that differentiate Pcc from Dickeya chrysanthemi and from P. carotovorum subsp. brasiliensis. The strains were identified as belonging to the genus Pectobacterium, though they did not fit the biochemical nor the molecular classification standards for subspecies differentiation, indicating significant diversity among the strains.

Pectobacterium é um táxon complexo de isolados bacterianos com características diversas. Compreende vários gêneros como Erwinia, Brenneria, Pectobacterium, Dickeya e Pantoea. Pectobacterium e Dickeya causam doenças em ampla variedade de plantas, incluindo a batateira, na qual são os agentes etiológicos da podridão mole dos tubérculos e da canela-preta de plantas cultivadas em campo.A caracterização de espécies de Pectobacterium permite a análise da diversidade de bactérias pectolíticas, podendo auxiliar estratégias de controle de doenças bacterianas em plantas. O objetivo deste trabalho foi caracterizar bioquímica, fisiológica e molecularmente isolados de Pectobacterium sp. provenientes de diferentes locais e hospedeiros. Os isolados foram caracterizados pelos testes de fermentação de glicose, Gram, catalase, oxidase, crescimento à 37 ºC, redução de substâncias a partir de sacarose, atividade da fosfatase, produção de indol, produção de ácido a partir de sorbitol, melibiose, citrato e lactose, patogenicidade em batata e reação de hipersensibilidade. Para a caracterização molecular, foram utilizados os pares de primersECA1f/ECA2r e EXPCCF/EXPCCR [específicos para P. atrosepticum e P.carotovorum subsp. carotovorum(Pcc), respectivamente] e as tríades de primers 1491f/L1RA/L1RG e Br1f/L1RA/L1RG, para diferenciar Pcc de Dickeya chrysanthemi e de P. carotovorum subsp. brasiliensis. Os isolados foram identificados como pertencentes ao gênero Pectobacterium, no entanto, não se enquadraram na classificação bioquímica e tampouco molecular para diferenciação das subespécies, demonstrando a grande diversidade dos mesmos.

Clostridial diseases diagnosed in cattle from the South of Rio Grande do Sul, Brazil. A forty-year survey (1978-2018) and a brief review of the literature / Clostridioses diagnosticadas em bovinos no sul do Rio Grande do Sul. Uma pesquisa de quarenta anos (1978-2018) e breve revisão da literatura

Clostridial diseases are important causes of livestock losses in the southern Rio Grande do Sul. Since 1978 annual surveys conducted at the "Laboratório Regional de Diagnóstico" of the "Universidade Federal de Pelotas" (LRD-UFPel) have shown that clostridial diseases represent 10.40% of the bacterial diseases diagnosed in cattle and 1.65% of all diseases diagnosis in cattle over a 40-year period. The purpose of this study is to review the clinical, epidemiological and pathological aspects of the clostridial diseases diagnosed in cattle from January 1978 to December 2018 at the LRD-UFPel in the hopes that it will constitute a useful guide for field veterinary practitioners and interested farmers. We assessed and review the necropsy protocols of 6,736 cattle; these necropsies were performed either by LRD-UFPel faculty or by field veterinary practitioners; 111 outbreaks (1.65%) were diagnosed as clostridial disease, distributed as follows: 35 outbreaks of tetanus, 34 of blackleg, 23 of bacillary hemoglobinuria, 11 of malignant edema (gas gangrene), and eight of botulism. Approximately 904, from a total of 42,480 cattle at risk, died in these outbreaks.(AU)

Clostridioses são doenças produzidas por alguma das espécies do gênero Clostridium e são importantes causas de perdas pecuárias no sul do Rio Grande do Sul. Pesquisas anuais realizadas no Laboratório Regional de Diagnóstico da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas (LRD-UFPel) desde 1978 demonstraram que as clostridioses representaram 11,1% das doenças bacterianas diagnosticadas em bovinos e 1,65% de todos os diagnósticos de doenças em bovinos ao longo de 40 anos. O objetivo deste estudo é revisar os aspectos clínicos, epidemiológicos e patológicos das clostridioses diagnosticadas de janeiro de 1978 a dezembro de 2018, pelo LRD/UFPel com a intenção de que esse trabalho possa servir de guia útil para os veterinários de campo e fazendeiros interessados. Foram avaliados e revisados os protocolos de necropsia de 6.736 bovinos; essas necropsias foram realizadas pelo pessoal do LRD/UFPel ou por veterinários de campo. Cento e quatro (1,16%) casos foram diagnosticados como clostridioses, distribuídos da seguinte forma: 35 surtos de tétano, 34 de carbúnculo sintomático, 23 de hemoglobinúria bacilar, 11 de edema maligno (gangrena gasosa) e oito de botulismo. Aproximadamente 904, de um total de 42.480 bovinos sob-risco, morreram nesses surtos.(AU)

Molecular characterization of virulence genes cctA, nanA, and fliC in Clostridium chauvoei from Rio Grande do Sul and São Paulo State, Brazil / Caracterização molecular dos genes de virulência cctA, nanA e fliC em Clostridium chauvoei isolados no Rio Grande do Sul e São Paulo, Brasil

ABSTRACT: Clostridium chauvoei toxin A (CctA), neuraminidase (NanA), and flagellin (FliC) proteins contribute to the pathogenicity of Clostridium chauvoei, the causative agent of blackleg in cattle. The aim of this study was to analyze the genetic variability of cctA, nanA, and fliC genes in C. chauvoei isolates from the Rio Grande do Sul and São Paulo state- Brazil, during different sampling periods. The presence of these genes was verified through PCR amplification and partial gene sequencing of 17 strains. Alignment of PCR amplicons combined with bioinformatics analysis was used in an attempt to study the variability across C. chauvoei solates. The similarity among the partial sequences of cctA and nanA genes was 100%. The sequencing of fliC revealed three different paralog alleles of flagellin, and two strains were seen to be polymorphic, with amino acid alterations in the predicted protein. Overall, this study indicates that strains of C. chauvoei isolated in Brazil are highly conserved with respect to the virulence factors evaluated.

RESUMO: Toxina A de Clostridium chauvoei (CctA), neuraminidase (NanA) e flagelina (FliC) são proteínas que contribuem para a patogenicidade de Clostridium chauvoei, o agente causador do carbúnculo sintomático em bovinos. O objetivo deste estudo foi analisar a variabilidade genética dos genes cctA, nanA, e fliC em C. chauvoei isolados em diferentes períodos no Rio Grande do Sul e São Paulo. A presença destes genes foi verificada pela amplificação dos produtos da PCR e sequenciamento parcial dos genes de 17 cepas. Os alinhamentos da amplificação dos produtos da PCR combinados com a análise de bioinformática foram utilizados na tentativa de avaliar a variabilidade dos genes entre os isolados de C. chauvoei. A similaridade do sequenciamento parcial dos genes cctA e nanA foi 100%. O sequenciamento do fliC revelou três alelos paralogos diferentes de flagelina e duas cepas mostraram polimorfismos, causando alterações na sequência de aminoácidos. As cepas de C. chauvoei isoladas no Brasil mostraram-se altamente conservadas em relação aos fatores de virulência avaliados neste estudo.

Blackleg in a free-range brown brocket deer (Mazama gouazoubira) / Carbúnculo sintomático em veado virá de vida livre (Mazama gouazoubira)

A case of blackleg in a brown brocket deer (Mazama gouazoubira) associated with trauma from being hit by a car in southern Rio Grande do Sul is reported. The clinical signs included fever, dehydration and lethargy that worsened progressively until 36 hours after the accident, when the animal died. In the fore right limb, there was a comminuted closed fracture of the radius and ulna but no skin wounds were observed. Grossly, the musculature of the pelvic limbs presented hemorrhage, edema and emphysema. Microscopically, the muscles of both rear legs had necrosis, edema, hemorrhage and mild inflammatory infiltration of neutrophils. Clostridium chauvoei was cultured from affected skeletal muscles, and it was also detected by immunohistochemistry, confirming a diagnosis of blackleg. The overlapping habitat of cattle and brown brocket deer is proposed as a predisposing factor in this case and alerts to spillover cases maybe happening in this region. In addition, blackleg should be included as differential diagnoses of deer with post-traumatic myositis.(AU)

Descreve-se um caso de carbúnculo sintomático em um veado-virá (Mazama gouazoubira), macho, jovem, resgatado após atropelamento em uma rodovia na região sul do Rio Grande do Sul. O cervídeo apresentou febre, desidratação e letargia, progredindo para a morte em 36 horas. No membro torácico direito foi observado fratura cominutiva fechada de rádio e ulna sem a presença de feridas perfurantes. Na necropsia foi observada hemorragia, edema e enfisema na musculatura dos membros pélvicos. Microscopicamente, os músculos dos membros pélvicos apresentaram necrose, edema, hemorragia e discreto infiltrado inflamatório neutrofílico. Houve o isolamento de Clostridium chauvoei e marcação positiva na técnica de IHQ com anticorpo monoclonal anti-C. chauvoei, confirmando o diagnóstico de carbúnculo sintomático. A sobreposição de habitat entre bovinos domésticos e cervídeos pode ser um fator de risco para esta doença e chama a atenção para casos de "spillover" que podem estar ocorrendo na região. Adicionalmente, sugere-se que o carbúnculo sintomático seja incluído nos diagnósticos diferenciais de cervídeos que apresentam miosite pós-traumática.(AU)

Blackleg in cattle in the state Mato Grosso do Sul, Brazil: 59 cases / Carbúnculo sintomático em bovinos em Mato Grosso do Sul: 59 casos

This study aimed to review cases of blackleg (Clostridium chauvoei infection) diagnosed in cattle from Midwestern Brazil from 1994 to 2014 considering epidemiological, clinical, necropsy and histopathological findings. Also the following laboratory tests were used for the diagnosis of some cases of blackleg: microbiological culture and identification of the agent, microbiological culture and identification of the agent by the polymerase chain reaction (PCR), and identification of the agent in formalin fixed paraffin embedded tissues (FFPE). Criteria for presumptive diagnosis of blackleg included necrohemorrhagic emphysematous myositis consisting of inflammatory infiltrate, coagulative necrosis of myofiber, interstitial edema, hemorrhage, and gas bubbles between myofibers. Fifty nine cases from 51 outbreaks of blackleg were found, which corresponded to 1.1% of 5,375 cattle deaths investigated. In five of those outbreaks, samples of affected muscles cultures for the identification of pathogenic clostridia were made. Another three samples of similar material were cultured for clostridia with subsequent identification of the isolate by PCR. Twelve samples of FFPE affected muscle fragments were submitted to PCR for identification of the etiological agent. Except for January, cases were observed in each month of the year, with higher numbers in July-October. Most affected cattle were in the age of 7-12 years, but calves younger than 6 month-old and older than 24 months were also observed. Vaccination histories were scarce. In 32 outbreaks some vaccination history was available, but only in two of those vaccination has been carried out properly. In 56 six cases the skeletal muscles were involved. Muscles of the hind limbs were the most affected. In ten cases muscles of the tongue, myocardium and diaphragm were also affected. In three of the cases the visceral form was observed. Deaths occurred after a clinical course of 6-24 hours, but in most cases cattle were found death. Sudden death was the outcome in visceral cases (cardiac) blackleg. Clostridium chauvoei was confirmed to be the cause by culturing in 5 cases, and by PCR and histopatology in 8 cases. Bacterial culture followed by PCR did not demonstrate C. chauvoei. Calculation of the economic impact indicates that blackleg is a frequent disease in the state of Mato Grosso do Sul (MS) that inflicts significant economic loss. The amount of these losses would be reduced through proper vaccination programs against the prevalent strains of C. chauvoei in the region.(AU)

Este estudo foi realizado com o objetivo de descrever casos de carbúnculo sintomático (infecção por Clostridium chauvoei) diagnosticados em bovinos do Centro-Oeste brasileiro de 1994-2014, avaliando a epidemiologia, os sinais clínicos, os achados de necropsia e a histopatologia; objetivou-se também avaliar os seguintes testes laboratoriais para o diagnóstico de carbúnculo sintomático: cultura microbiológica e identificação do agente, cultura microbiológica e identificação do agente por reação em cadeia de polimerase (PCR) e identificação do agente em material fixado em formol e incluído em parafina (FFIP). Os critérios para o diagnóstico presuntivo de carbúnculo sintomático incluíram miosite necro-hemorrágica enfisematosa, caracterizada por infiltrado inflamatório, necrose de coagulação de miofribras, edema intersticial, hemorragia e bolhas de gás em meio às miofribras. Cinquenta e nove casos oriundos de 51 surtos foram encontrados, o que corresponde a 1,1% das 5.375 mortes de bovinos investigadas. Em cinco desses casos, amostras do músculo afetado foram cultivadas para clostrídios patogênicos. Amostras semelhantes de outros três animais foram cultivadas para clostrídios e os isolamentos identificados subsequentes por PCR. Doze fragmentos de músculo afetado FFIP foram submetidos a PCR para identificação do agente etiológico. Com exceção de janeiro, os casos de carbúnculo sintomático foram observados em todos os meses do ano com uma maior incidência em junho-outubro. A faixa etária da maioria dos bovinos afetados era de 7-12 anos de idade, mas bovinos mais jovens que 6 meses e mais velhos que 24 meses foram também afetados. Os históricos de vacinação eram escassos nesses surtos. Em 32 surtos havia alguma informação sobre a vacinação, mas em apenas dois casos a vacinação tinha sido realizada adequadamente. Cinquenta e seis casos de carbúnculo sintomático deste estudo eram casos clássicos afetando os músculos esqueléticos. Os músculos mais afetados foram os dos membros pélvicos. Em dez casos os músculos da língua, miocárdio e diafragma estavam também afetados. Apenas três dos casos apresentaram a forma visceral (cardíaca). O curso clínico foi de 6-24 horas, mas na maioria dos casos os bovinos foram encontrados mortos. Em casos da forma visceral ocorria morte súbita. Clostridium chauvoei foi confirmado como o agente causal por cultura em cinco casos e por PCR em amostra FFIP em 8 casos. Cultura bacteriana seguida de PCR do isolado não demonstrou C. chauvoei. Carbúnculo sintomático é uma doença frequente em bovinos no Mato Grosso do Sul podendo provocar importantes prejuízos para os produtores rurais. Esses prejuízos podem ser reduzidos através de um programa de vacinação adequado usando-se vacinas eficazes contra cepas de C. chauvoei prevalentes na região.(AU)